Период выполнения: 08.08.2019 – 31.12.2019
Основные результаты, полученные на этапе проекта:
Работы за счет средств гранта:
1 Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках проекта.
Проведен анализ современных отечественных и зарубежных литературных источников (124 информационных источника), который подтвердил актуальность и высокую практическую значимость направления по усовершенствованию скрининговых тестов, позволяющих определять наличие кислотоустойчивых бактерий непосредственно в диагностическом материале, определять принадлежность выявленных бактерий к МБТК или к НТМБ и определять генотипическую ЛУ, как минимум к рифампицину и изониазиду в одном тесте, а также важность разработки простых методов оценки активности туберкулезного процесса по выявлению молекулярных маркеров, чтобы иметь возможность контролировать эффективность терапии туберкулеза.
2 Проведение патентных исследований в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.
Проведенные патентные исследования позволили выявить наиболее близкие по своей сущности изобретения. Проведя подробный анализ, можно утверждать, что разработки, создаваемые при выполнении данного проекта, могут быть предложены в качестве потенциально охраноспособных, т.е. возможны оформление и подача в ФИПС заявок с целью получения патента на изобретение и (или) полезную модель.
3 Экспериментальные исследования согласно ПГ по каждому продукту
3.1 Метод, позволяющий проводить быстрый скрининг на наличие возбудителя туберкулеза в образцах мокроты
Отработан метод окраски клеточной стенки МБТ с инновационными флуоресцентными красителями, скомбинированными с зондами на основе трегалозы. Установлено, что флюоресцентные красители, интегрировзанные с зондом на основе трегалозы, при инкубации с культурой МБТ (1 час при температуре 37°С с последующей отмывкой физиологическим раствором) оптимально окрашивает клеточную стенку МБТ, а окрашивание фона – менее интенсивное.
3.2 Тест на микросистемах полного анализа для молекулярно-генетического выявления микобактерий туберкулезного комплекса, видовой идентификации и определения лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (рифампицину, изониазиду) с использованием DestiNA технологии
Разработана панель мишеней в геноме ДНК МБТ, необходимая для создания молекулярно-генетического теста для определения лекарственной устойчивости одновременно к изониазиду и рифампицину, что позволит создать тест, обладающий высокими диагностическими характеристиками (прогнозируемые чувствительность не менее 95%, специфичность – 100%, диагностическая эффективность – не менее 98%, положительная прогностическая ценность – 100%, отрицательная прогностическая ценность – не менее 95%). Впервые для разработки дизайна теста для диагностики лекарственной устойчивости был проведен анализ спектра мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (ПТП) с оценкой их клинической значимости и тренда распространения. Подобный подход позволит отобрать необходимый и достаточный набор мишеней и тем самым минимизировать затраты при создании высокоэффективного теста.
Валидированы праймеры и зонды для выявления МБТ и видовой идентификации, используемые в колонках в формате lab-on-chip: предел детекции метода с визуализацией результатов электрофорезом и на колонках в формате lab-on-chip составил 10 000 микобактериальных клеток в диагностическом образце, как при выявлении микобактерий туберкулезного комплекса, так и при видовой идентификации. Проведен первый этап испытаний компонента теста микросистем полного анализа: отобраны 1000 образцов с разным количественным содержанием ДНК МБТ и нетуберкулезных микобактерий и получены данные с использованием референтного набора.
3.3 Тест-система для количественного определения ассоциированных с туберкулезом видов микроРНК для мониторинга эффективности противотуберкулезной химиотерапии
Депонированы образцы сыворотки венозной крови от 40 пациентов.
Полученные за отчетный период результаты в целом соответствуют требованиям к выполняемому проекту. Отклонение от требований к проекту заключается в изменении одного из компонентов теста на микросистемах полного анализа вследствие принятого консорциумом решения об улучшении продукта (сокращение этапов анализа с одновременным улучшением информативности теста), что повлекло за собой задержку с разработкой и передачей продукта. В связи с этим часть работ, запланированных на 2019 год будет перенесена на 2020 год.
Работы выполнены на методическом уровне, соответствующем основным современным мировым тенденциям. Комплексный подход к разработке быстрых тестов диагностики туберкулеза одновременно по трем направлениям (скрининг, молекулярно-генетическая диагностика и определение маркеров активности туберкулезного процесса) делает НИР уникальной в ряду аналогичных исследований в этой области.
Работы, выполненные иностранным партнером:
Синтезированы PNA-зонды для определения МБТК, видовой идентификации и чувствительности к рифампицину и изониазиду. Изготовлены колонки с полимерной мембраной с зондами в новом формате, позволяющие за один этап выявлять МБТК и проводить видовую идентификацию, разработана ПЦР целевых последовательностей и оптимизирован этап колориметрической детекции на мембране для тестов на выявление и видовую идентификацию. Создан прототип микрофлюидного картриджа для выделения ДНК из мокроты. Подобраны мишени микроРНК, разработаны PNA-зонды.
По результатам первого этапа проекта опубликовано две статьи:
- Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Андриевская И.Ю., Черноусова Л.Н., Эргешов А. Изониазид-резистентные Mycobacterium tuberculosis: частота выявления, спектры резистентности и генетические детерминанты устойчивости. Вестник РГМУ. 2020; (1):16-22. doi: 10.24075/vrgmu.2020.001 / Andreevskaya SN , Smirnova TG, Larionova EE, Andrievskaya IYu, Chernousova LN, Ergeshov A. Isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis: prevalence, resistance spectrum and genetic determinants of resistance. Bulletin of RSMU. 2020; (1). doi: 10.24075/brsmu.2020.001.(RUS) / (ENG)