Проект выполняется в рамках ФЦП:

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы»

Номер Соглашения Электронного бюджета: 075-15-2019-1472

Внутренний номер соглашения 05.586.21.0065

 

Тема: «Комплексное решение для быстрой и высокоэффективной диагностики туберкулеза легких, включающее выявление, определение лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза и контроль эффективности противотуберкулезной химиотерапии»

Ключевые слова: туберкулез, латентность, микобактерии туберкулеза, лекарственная чувствительность, молекулярно-генетические методы, диагностика туберкулеза, микроРНК, эффективность химиотерапии, биомаркеры, микроскопия

 

Проект сфокусирован на быстрой диагностике туберкулеза и мониторинге лечения, которые можно распространить на лаборатории любого уровня, а также использовать в полевых условиях, в том числе в труднодоступных районах, и имеет три основные задачи:

1.Разработать методику скрининга микобактерий в мокроте в центрах первичной медицинской помощи, используя новые недорогие портативные оптические устройства

  1. Обеспечить быстрое и точное обнаружение микобактерий и определение устойчивости к самым эффективным противотуберкулезным препаратам рифампицину и изониазиду
  2. Определять активность туберкулезного процесса и контролировать терапию с использованием микроРНК в качестве биомаркеров.1) Глобальная цель проекта: совершенствование диагностики туберкулеза за счет разработки комплексного решения для ускоренной диагностики туберкулеза, в том числе лекарственно-устойчивого, что приведет к повышению эффективности диагностики на местах и своевременному назначению адекватной схемы химиотерапии туберкулеза, а также позволит контролировать результат терапии.

Цели выполнения исследований согласно ТЗ: провести валидацию и испытания разработанных в рамках Проекта а) нового метода, позволяющего проводить быстрый скрининг на наличие возбудителя туберкулеза в образцах мокроты; б) нового теста на микросистемах полного анализа для молекулярно-генетического выявления, видовой идентификации и определения лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (рифампицину, изониазиду); в) новой тест-системы для количественного определения ассоциированных с туберкулезом видов микроРНК для мониторинга эффективности противотуберкулезной химиотерапии.

В результате реализации проекта будет достигнуто повышение эффективности диагностики туберкулеза  в РФ за счет внедрения уникальных технологий, не предъявляющих высоких требований к инфраструктуре лаборатории и не требующих применения дорогостоящего оборудования (термоциклеры, микроскопы), что позволит проводить диагностику туберкулеза не только в специализированных лабораториях, но и в лабораториях общего профиля; проведена адаптация разработанного иностранным партнером оборудования к условиям российских диагностических лабораторий; усовершенствован и упрощен контроль эффективности химиотерапии туберкулеза.

Проект является международным. В состав консорциума входит ряд научных и коммерческих организаций из Европы и Индии:

  1. ЭДИНБУРГСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ (UEDIN), Великобритания
  2. ДЕСТИНА ГЕНОМИКА (DGSL), Испания
  3. УНИВЕРСИТЕТ ХЕРИОТА-УАТТА (HWU), Великобритания
  4. ПАДУАНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ (UNIPD), Италия
  5. ОПТОЭЛЕКТРОНИКА ИТАЛИЯ SRL (Optoi), Италия
  6. СТРАТЕГИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА SL (GAS), Испания
  7. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТУБЕРКУЛЕЗА (NIRT), Индия
  8. SHANMUKHA INNOVATIONS PRIVATE LIMITED (SIPL), Индия

  • Этап 1 (Нажмите, чтобы раскрыть)

    Период выполнения: 08.08.2019 — 31.12.2019

    Основные результаты, полученные на этапе проекта:

    Работы за счет средств гранта:

    1 Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках проекта.

    Проведен анализ современных отечественных и зарубежных литературных источников (124 информационных источника), который подтвердил актуальность и высокую практическую значимость направления по усовершенствованию скрининговых тестов, позволяющих определять наличие кислотоустойчивых бактерий непосредственно в диагностическом материале, определять принадлежность выявленных бактерий к МБТК или к НТМБ и определять генотипическую ЛУ, как минимум к рифампицину и изониазиду в одном тесте, а также важность разработки простых методов оценки активности туберкулезного процесса по выявлению молекулярных маркеров, чтобы иметь возможность контролировать эффективность терапии туберкулеза.

    2 Проведение патентных исследований в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.

    Проведенные патентные исследования позволили выявить наиболее близкие по своей сущности изобретения.  Проведя подробный анализ, можно утверждать, что разработки, создаваемые при выполнении данного проекта, могут быть предложены в качестве потенциально охраноспособных, т.е. возможны оформление и подача в ФИПС заявок с целью получения патента на изобретение и (или) полезную модель.

    3 Экспериментальные исследования согласно ПГ по каждому продукту

    3.1 Метод, позволяющий проводить быстрый скрининг на наличие возбудителя туберкулеза в образцах мокроты

    Отработан метод окраски клеточной стенки МБТ с инновационными флуоресцентными красителями, скомбинированными с зондами на основе трегалозы. Установлено, что флюоресцентные красители, интегрировзанные с зондом на основе трегалозы, при инкубации с культурой МБТ (1 час при температуре 37°С с последующей отмывкой физиологическим раствором) оптимально окрашивает клеточную стенку МБТ, а окрашивание фона – менее интенсивное.

    3.2 Тест на микросистемах полного анализа для молекулярно-генетического выявления микобактерий туберкулезного комплекса, видовой идентификации и определения лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (рифампицину, изониазиду) с использованием DestiNA технологии

    Разработана панель мишеней в геноме ДНК МБТ, необходимая для создания молекулярно-генетического теста для определения лекарственной устойчивости одновременно к изониазиду и рифампицину, что позволит создать тест, обладающий высокими диагностическими характеристиками (прогнозируемые чувствительность не менее 95%, специфичность – 100%, диагностическая эффективность – не менее 98%, положительная прогностическая ценность – 100%, отрицательная прогностическая ценность – не менее 95%). Впервые для разработки дизайна теста для диагностики лекарственной устойчивости был проведен анализ спектра мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (ПТП) с оценкой их клинической значимости и тренда распространения. Подобный подход позволит отобрать необходимый и достаточный набор мишеней и тем самым минимизировать затраты при создании высокоэффективного теста.

    Валидированы праймеры и зонды для выявления МБТ и видовой идентификации, используемые в колонках в формате lab-on-chip: предел детекции метода с визуализацией результатов электрофорезом и на колонках в формате lab-on-chip составил 10 000 микобактериальных клеток в диагностическом образце, как при выявлении микобактерий туберкулезного комплекса, так и при видовой идентификации. Проведен первый этап испытаний компонента теста микросистем полного анализа: отобраны 1000 образцов с разным количественным содержанием ДНК МБТ и нетуберкулезных микобактерий и получены данные с использованием референтного набора.

    3.3 Тест-система для количественного определения ассоциированных с туберкулезом видов микроРНК для мониторинга эффективности противотуберкулезной химиотерапии

    Депонированы образцы сыворотки венозной крови от 40 пациентов.

    Полученные за отчетный период результаты в целом соответствуют требованиям к выполняемому проекту. Отклонение от требований к проекту заключается в изменении одного из компонентов теста на микросистемах полного анализа вследствие принятого консорциумом решения об улучшении продукта (сокращение этапов анализа с одновременным улучшением информативности теста), что повлекло за собой задержку с разработкой и передачей продукта. В связи с этим часть работ, запланированных на 2019 год будет перенесена на 2020 год.

    Работы выполнены на методическом уровне, соответствующем основным современным мировым тенденциям. Комплексный подход к разработке быстрых тестов диагностики туберкулеза одновременно по трем направлениям (скрининг, молекулярно-генетическая диагностика и определение маркеров активности туберкулезного процесса) делает  НИР уникальной в ряду аналогичных исследований в этой области.

    Работы, выполненные иностранным партнером:

    Синтезированы PNA-зонды для определения МБТК, видовой идентификации и чувствительности к рифампицину и изониазиду. Изготовлены колонки с полимерной мембраной с зондами в новом формате, позволяющие за один этап выявлять МБТК и проводить видовую идентификацию, разработана ПЦР целевых последовательностей и оптимизирован этап колориметрической детекции на мембране для тестов на выявление и видовую идентификацию. Создан прототип микрофлюидного картриджа для выделения ДНК из мокроты. Подобраны мишени микроРНК, разработаны PNA-зонды.

    По результатам первого этапа проекта опубликовано две статьи:

    1. Эргешов А.Э., Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н. Новые технологии микробиологической диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза. Вестник РАМН. 2019; 74(6):428–437. doi: 10.15690/vramn1163.
    1. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Андриевская И.Ю., Черноусова Л.Н., Эргешов А. Изониазид-резистентные Mycobacterium tuberculosis: частота выявления, спектры резистентности и генетические детерминанты устойчивости. Вестник РГМУ. 2020; (1):16-22. doi: 10.24075/vrgmu.2020.001 / Andreevskaya SN , Smirnova TG, Larionova EE, Andrievskaya IYu, Chernousova LN, Ergeshov A. Isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis: prevalence, resistance spectrum and genetic determinants of resistance. Bulletin of RSMU. 2020; (1). doi: 10.24075/brsmu.2020.001.(RUS) / (ENG)

  • Этап 2 (Нажмите, чтобы раскрыть)

    Период выполнения: 01.01.2020-30.06.2020

    Основные результаты, полученные на этапе проекта:

    За отчетный период охарактеризована и депонирована ДНК для оптимизации этапа гибридизации ДНК-мишени на специфических PNA-зондах в колонках в формате lab–on-a-chip с лиофилизированными реагентами и полимерной мембраной с использованием DestiNA технологии для определения лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду. Депонированы охарактеризованные образцы ДНК для проведения испытаний колонок в формате lab–on-a-chip с лиофилизированными реагентами и полимерной мембраной с иммобилизованными на ней специфическими PNA-зондами для определения лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду. Депонированы и охарактеризованы референтными методами образцы диагностического материала для испытания микрофлюидных картриджей и электронного модуля для выделения ДНК и испытания теста на микросистемах полного анализа в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний. Разработана Программа и методики испытаний тест-системы для количественного определения ассоциированных с туберкулезом видов микроРНК для мониторинга эффективности противотуберкулезной химиотерапии. Продолжается получение сыворотки крови от больных с верифицированным диагнозом «туберкулез легких» до начала и в процессе противотуберкулезной химиотерапии; лиц из группы риска (контакты) и здоровых волонтеров. Разработана Программа и методики испытаний метода, позволяющего проводить быстрый скрининг на наличие возбудителя туберкулеза в образцах мокроты. Охарактеризованы и депонированы образцы диагностического материала для испытания метода, позволяющего проводить быстрый скрининг на наличие возбудителя туберкулеза в образцах мокроты, в том числе на соответствие требованиям ТЗ, согласно разработанной Программе и методике испытаний.

    Большинство работ иностранного партнера было приостановлено из-за карантина по Covid-19 в Европе. Продолжались работы по изготовлению микрофлюидных картриджей и электронного модуля для выделения ДНК. Изготовлено устройство для визуализации, оценены параметры детекции, разработаны  компоненты для электронной обработки результатов, полученных на устройстве для визуализации. Получателю передано устройство для визуализации, оснащенное электронной системой обработки данных. Разработаны протоколы для прямого обнаружения микроРНК в сыворотке/плазме крови без необходимости выделения РНК.

Поделиться: